Líneas de investigación
El Laboratorio Nanoscopy-UGR permite realizar una gran cantidad de experimentos de imagen de luminiscencia avanzada, incluyendo espectroscopía de molécula única y microscopía de súper-resolución, trabajando con muestras de diverso tipo, desde cultivos celulares, organoides, o nuevos materiales.
Hasta la fecha, se ha venido trabajando en diversas líneas, incluyendo colaboraciones con varios agentes internacionales y nacionales, empresas del sector de la biomedicina, y grupos de la Unidad de Excelencia en Química. Por ejemplo, se han empleado sensores luminiscentes para entender cómo las células tumorales o las células reguladoras de la respuesta inmune, modifican su forma de emplear la energía, mediante finos mecanismos de adaptación. Asimismo, se han desarrollado tecnologías de imagen para la detección temprana de ciertos biomarcadores de enfermedades como el cáncer o de disfunciones hepáticas, o para estudiar el mecanismo íntimo de formación de agregados neurotóxicos en el mal Alzhéimer. La mejor comprensión de los fundamentos por los que estos agregados proteicos, precursores de las fibras amiloides, se forman proporcionará información de evidente interés para la lucha contra enfermedades neurodegenerativas. Finalmente, se están empleando las técnicas avanzadas de microscopía del Laboratorio Nanoscopy-UGR para la caracterización de nuevos materiales luminiscentes con diversas aplicaciones tecnológicas.
Equipamiento
El Laboratorio se compone de dos equipos bien diferenciados, con capacidades similares y complementarias. En concreto, las características técnicas son las siguientes:
- Microscopio MicroTime 200 de PicoQuant (en adelante MT200), que consta de:
- 6 fuentes láser de excitación pulsada
- 4 detectores
- Electrónica de contaje de fotones individuales multicanal
- Láser sintonizable en la región NIR, pulsado en fs, para excitación bifotónica
- Espectrógrafo y cámara EMCCD ultrasensible
- Microscopio Abberior Expert Line (en adelante Abberior), que consta de:
- 5 fuentes láser pulsadas
- 4 detectores
- 2 juegos de electrónica para contaje de fotones individuales
- Escáner galvánico
- Cámara EMCCD
- 4 fuentes nanoLEDs para epi-iluminación
Con este equipamiento, pueden desarrollarse los siguientes tipos de experimentos:
- Nanoscopia mediante depleción estimulada de la emisión (STED, stimulated emission depletion). Las técnicas de nanoscopia han revolucionado la información molecular obtenida, al superar el límite de resolución óptica, durante años supuesto una barrera infranqueable para las técnicas de microscopía óptica. De hecho, en 2014, el premio Nobel de Química fue galardonado a los investigadores Eric Betzig, Stefan W. Hell y William E. Moerner por el desarrollo de los principios fundamentales de estas tecnologías. En concreto, la infraestructura existente permite recolectar imágenes de nanoscopia STED en cuatro canales simultáneamente.
- Microscopía de tiempos de vida de fluorescencia (FLIM) y tiempo de vida de fosforescencia (PLIM). La microscopía FLIM es una técnica de imagen netamente multiparamétrica, en la que los fotones emitidos por la muestra son analizados temporalmente, en la escala de los picosegundos, para poder estudiar la dinámica del estado excitado de los colorantes fluorescentes. Esta técnica permite el desarrollo de nuevas metodologías de sensado, con especial interés a su aplicación intracelular y en nuevos materiales. En concreto, la infraestructura permite la recolección de imágenes FLIM simultáneamente en cuatro canales de detección, y con cinco diferentes longitudes de onda de excitaciones, permitiendo experimentos con decenas de combinaciones ópticas. Además, esta infraestructura es de las pocas existentes en España que permiten integrar imágenes PLIM, cuando los emisores luminiscentes tienen tiempos de vida en la escala de los s o incluso ms.
- Combinación STED-FLIM. Uno de los recientes avances científicos en el campo es precisamente la combinación de las dos técnicas anteriores, con beneficios mutuos. La robusta información cuantitativa de la microscopía FLIM se beneficia de una mayor resolución óptica, y la reconstrucción de las imágenes de nanoscopia mejoran notablemente con la aplicación de ventanas temporales en el análisis de los fotones emitidos. La infraestructura de la UGR es la primera y, hasta la fecha, única en España capaz de esta combinación.
- Imagen de anisotropía de fluorescencia. La infraestructura se dotó con sistemas de excitación y detección capaces de controlar la polarización de la radiación incidente y el análisis de la polarización de la radiación emitida. Se permiten dos excitaciones diferentes, y medida de anisotropía de fluorescencia en dos combinaciones de dos colores distintos. Esta infraestructura es, hasta la fecha, la única en Europa que permite la combinación de imagen de anisotropía-STED-FLIM. Esta combinación fue un desarrollo tecnológico específico que la compañía fabricante del equipo, Abberior (compañía fundada por el inventor de la técnica STED, Stefan Hell), realizó para esta infraestructura concreta.
- Imagen con excitación bifotónica. El laboratorio Nanoscopy-UGR dispone de una fuente de excitación fs-NIR sintonizable para la excitación multifotónica, con dos salidas diferentes, que pueden emplearse simultáneamente o alternativamente en modalidad de PIE (pulsed interleaved excitation). La salida sintonizable cubre el intervalo desde 650 hasta 1300 nm (para excitación bifotónica entre 375 y 650 nm) y una salida de longitud de onda fija de 1050 nm (para excitación bifotónica a 525 nm). Así, este tipo de excitación, que ofrece mayor resolución que un microscopio confocal convencional y una mayor penetrabilidad en muestras complejas dispersantes, como pueden ser tejidos orgánicos, puede además combinarse con las modalidades de imagen descritas anteriormente –a saber, FLIM, PLIM o anisotropía– en varios canales de detección.
- Imagen espectral. Uno de los instrumentos está equipado con una salida a un espectrógrafo de alta resolución (con tres redes de difracción de 300, 600 y 1200 líneas/mm) y una cámara de alta sensibilidad EMCCD. Esta combinación permite obtener información espectral completa en distintos puntos de las imágenes.
- Espectroscopía de molécula única (SMF) y de correlación de fluorescencia (FCS). La extremada sensibilidad de esta instrumentación permite la detección de moléculas individuales mediante SMF y FCS. Estas técnicas han revolucionado igualmente la forma en la que los sistemas biológicos y macromoleculares son investigados, al tratarse de técnicas con la sensibilidad última de una sola molécula. Esta infraestructura permite la realización de experimentos de SMF, FCS, SMF-FRET y FCS-FRET, en cuatro canales de detección y con excitación simultánea o alternada de cinco fuentes diferentes, así como mediante la excitación bifotónica con el láser fs-NIR.
- Microscopía de fluorescencia por epifluorescencia y confocal. La infraestructura también permite su empleo en configuraciones más clásicas. Para imagen por epifluorescencia y microscopía óptica de transmisión, consta con una fuente de excitación por LEDs, con cuatro longitudes de onda, y una cámara de imagen rápida. Para su empleo en microscopía confocal, puede emplear cinco fuentes de excitación diferentes y cuatro canales de detección simultáneos. Durante esta anualidad se ha finalizado el Proyecto IE17_5421_UGR del programa de ayudas a infraestructuras y equipamientos de I+D+i para entidades de carácter público en el ámbito del Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020), con la ejecución de los expedientes de contratación UGR/2020/0141 (modificación y actualización del microscopio preexistente para acomodar las nuevas fuentes de excitación), UGR/2020/0163 (láser de excitación fs-NIR) y UGR/2021/0074 (paquete para control de la iluminación pulsada), peritajes y auditorías, y la redacción del informe final.
